À la mort de Henri II, son fils le jeune François II monte sur le trône. Il passe l’hiver 1559 à Blois où son épouse Marie Stuart a été élevée. Le départ du roi pour Amboise précède la découverte par les Guise du complot de la Renaudie. La conjuration d’Amboise échoue et les conspirateurs sont arrêtés le 17 mars. La répression marque le début des guerres de Religion.
Après la mort prématurée de François II (décembre 1560 ), Charles IX tente avec Catherine de Médicis un rapprochement avec les protestants, mais les troupes catholiques du duc François de Guise prennent la ville en juillet 1562. Durant l’hiver, les chefs catholiques (duc de Guise) et protestants (Gaspard de Coligny) se succèdent à la Cour de Blois. En mars 1572, on donne plusieurs fêtes à Blois pour l’arrivée de Henri de Navarre en vue de ses fiançailles avec Marguerite de Valois, sœur de Charles IX, célébrées en avril dans la chapelle du château. Le mariage célébré à Paris le 18 août constitue le prélude au massacre de la Saint-Barthélemy (24 août).
C’est sous le règne de Henri III que l’activité politique devient la plus intense. Le roi convoque les États Généraux à Blois à deux reprises. En 1576, on y réclame la suppression de la religion protestante tandis que le séjour de la Cour est émaillé de meurtres : Henri de Saint-Sulpice, favori du roi, tombe dans un piège tendu par Jean de Beaune et un capitaine des archers, nommé Briague, est tué par un soldat de la garde…
En 1588, Henri III réunit pour la deuxième fois les États Généraux à Blois afin de contrecarrer l’action de Henri de Guise, chef de la Ligue catholique et tout-puissant à Paris. Sentant l’hostilité des députés, ralliés au duc de Guise, Henri III décide d’en finir avec son rival après avoir feint de se réconcilier avec lui.
Le meurtre a lieu dans le château même, dans les appartements du roi, au deuxième étage, au matin du 23 décembre 1588. Convoqué au Conseil du roi, Guise est informé que le roi le mande dans son cabinet vieux. Pour s’y rendre, le duc doit traverser la chambre du roi. C’est là qu’il est assailli par une vingtaine de spadassins appartenant aux « Quarante-Cinq », corps gascon de la garde personnelle du roi.
D’une force peu commune, le duc entraîne quatre de ses assaillants, mais criblés de coups, il s’écroule près du lit du roi. D’après le Journal de Pierre de l’Étoile, Henri III, sort alors du cabinet où il s’est retiré et s’exclame en voyant le corps étendu de son ennemi : « Mon Dieu ! Qu’il est grand ! Il paraît encore plus grand mort que vivant ! » Le lendemain, le cardinal de Lorraine, frère du duc, emprisonné aussitôt après le meurtre, est assassiné à son tour. Leurs corps auraient été brûlés. Huit mois plus tard, Henri III est assassiné devant Paris par le poignard du moine ligueur Jacques Clément.
